Skuteczność Apiwarolu AS w latach 1981-2009 (2/2011)

Adam Dzierżawski, Wojciech Cybulski,Dorta Krasucka, Agnieszka Klimowicz

Warroza wywołana przez Varroa destructor jest zaraźliwą chorobą pasożytniczą czerwiu zasklepionego, trutni i robotnic o charakterze enzootycznym. W Polsce choroba pojawiła się w 1980 roku i początkowo rozwijała się bardzo dynamicznie. W 1984 roku tylko 3 województwa były wolne od zarazy. Szybkość rozprzestrzeniania się warrozy oraz rozmiary notowanych strat były istotną przyczyną poszukiwania metod rozpoznawania i zapobiegania chorobie oraz koniecznością udostępnienia skutecznych leków i sposobów jej zwalczania. Pierwszą grupą środków leczniczych, które zastosowano do zwalczania warrozy były preparaty roślinne, jak kolendra, macierzanka, anyż, lebiodka pospolita i inne. Natomiast pierwszą substancją farmakologicznie czynną zastosowaną w lecznictwie światowym do zwalczania warrozy była fenotiazyna używana w formie odymiania lub aerozolu w dawce 0,5 do 1,0 g/rodzinę. W Polsce używano również fenotiazyny w formie i dawkach analogicznych do stosowanych wcześniej w innych krajach oraz akarotoks, siarkę, waroasin, tedion, polyakaratoks, sulfenon, galecron, w tym również olejki eteryczne. Używane ówcześnie preparaty niekiedy niekorzystnie wpływały na rodziny pszczele i miały zróżnicowaną wartość terapeutyczną. Mimo usilnych działań administracji weterynaryjnej, organizacji pszczelarskich i stosowania przez pszczelarzy dostępnych środków, warroza postępowała i przynosiła duże straty. W tej sytuacji rozwiązaniem z wyboru było poszukiwanie nowych substancji farmakologicznie czynnych i opracowanie nowych leków do zwalczania warrozy, które byłyby skuteczne, bezpieczne i nieszkodliwe.

W podejmowanym leczeniu stosowano szereg leków oraz różne metody ich aplikacji. Początkowo były to preparaty pochodzenia roślinnego, następnie proste, powszechnie znane substancje, jak naftalina, tymol, siarka, kwasy organiczne i inne. Można przyjąć, że zwalczanie tej groźnej choroby to ciągłe poszukiwania nowych substancji czynnych. Jak podaje Bieńkowska, w Europie przetestowano około 180 substancji, spośród których tylko nieliczne okazały się skuteczne i nieszkodliwe dla pszczół. Do zwalczania warrozy również w Polsce stosowano w praktyce różne substancje czynne. Amitraza jest jedną z pierwszych po fenotiazynie syntetycznych substancji farmakologicznie czynnych, która okazała się skuteczna w zwalczaniu warrozy i wciąż pozostaje lekiem z wyboru w kraju i na świecie. W praktyce amitraza sporządzana jest do stosowania w formie aerozolu (oprysku) lub fumigacji w wyniku spalania tabletki (I generacja) i plastikowego paska nasyconego lub pokrytego substancją czynną, z której ulega ewaporacji (III generacja).

Z uwagi na kontrowersje dotyczące skuteczności Apiwarolu AS i różnic biorównoważności aktualnie stosowanych preparatów, postanowiono oszacować jego skuteczność na podstawie analizy dostępnego piśmiennictwa za okres od 1981 roku do 2009 roku oraz określić różnice istotne statystycznie dla poszczególnych okresów stosowania leku. Zwrócono uwagę nie tylko na skuteczności, ale również na nabywanie oporności pasożyta na amitraz.

Historia stosowania amitrazy

Wyniki badań doświadczalnych, jakie przeprowadził w latach 1981-1983 Romaniuk, były podstawą do opracowania technologii wytwarzania tabletki palnej zawierającej 12,5 mg amitrazy, jako substancji czynnej o działaniu kontaktowym, która rozprowadzana aktywnie przez pszczoły z dymem w środowisku ula poraża pasożyty na ich ciele. Preparat Apiwarol AS po wprowadzeniu ulepszeń i dostosowaniu do obowiązujących wymogów, jest dopuszczony jako lek pierwszej generacji do obrotu w Polsce od 1984 roku. Na bazie amitrazy „Biowet” w Puławach w 2004 roku wyprodukował i wprowadził na rynek dwa inne leki przeciwwarrozowe, Apiwar i Biowar. Apiwar zawierający 200 mg amitrazy nie znalazł zastosowania w praktyce i wkrótce został wycofany z rynku ze względu na małą zawartość substancji czynnej na powierzchni paska. Natomiast Biowar, zawierający 400 mg substancji czynnej inkorporowanej w plastikowy pasek do zawieszania w ulu, działający przez 6 tygodni lub dłużej w wyniku powolnego uwalniania substancji czynnej, niszczy pasożyty na pszczołach dorosłych i wychodzących z komórek. Zatem Apiwarol AS i Biowar zawierają tę samą substancję czynną. Jednak Biowar różni się zasadniczo od Apiwarolu AS dawką, czasem ekspozycji i sposobem oddziaływania na pasożyta. Odmienności te są na tyle istotne, że uzyskiwane rezultaty różniły się znacząco efektem terapeutycznym i możliwością wykształcania oporności u pasożyta. Zasadniczym czynnikiem, który ma istotny wpływ jest czas ekspozycji substancji aktywnej w środowisku ula, bo im dłuższe jest oddziaływanie, tym wykształcenie oporności staje się bardziej prawdopodobne. Jak podaje Marchetti, emulsyjna postać amitrazu wprowadzona w formę aerozolu lub dymu działa w pierwszej godzinie po zastosowaniu. Zalecane trzykrotne odymianie Apiwarolem AS wprowadza do ula 37,5 mg substancji czynnej na krótki okres. Natomiast przy stosowaniu pasków Biowaru, substancja czynna (400 mg) w środowisku ula działa na pszczoły i pasożyta przez minimum 6 do 8 tygodni.

Coraz częściej pojawiające się doniesienia o zmniejszonej skuteczności Apiwarolu AS sugerowały powstanie oporności pasożyta na substancję czynną. Autorzy nie podają jednak istoty zjawiska oporności, poprzestając na podkreśleniu, iż są to efekty wieloletnich obserwacji nad stosowaniem preparatu. Milani w 1995 roku na podstawie doświadczeń laboratoryjnych i badań w pasiece opisał zjawisko powstawania oporności Varroa destructor na fluvalinat. Stosunkowo szybkie pojawianie się oporności roztocza na ten pyretroid, jest aktualnie dobrze rozpoznany. W Polsce podobne efekty stwierdzili Londzin i Śledziński. Natomiast badania amitrazu prowadzone w USA (gdzie był i jest powszechnie stosowany) wskazują, że zjawisko oporności pasożyta może mieć miejsce. Jak podaje Pidek, pszczelarze amerykańscy stosują amitraz głównie w formie pasków, nie uzyskując najlepszych wyników w terapii warrozy. Zauważa jednak, że substancja czynna zmieszana z dymem jest lepiej rozprowadzana w ulu i jest skuteczniejsza. Pierwsze badania wrażliwości na amitraz w Polsce przeprowadziła Pohorecka. W porównawczych badaniach laboratoryjnych testem czasu śmiertelności stwierdziła, że długość okresu od kontaktu pasożyta z substancją do chwili śmierci jest różny, co pozwala wnioskować o odmiennej wrażliwości pasożytów nawet w jednej pasiece.

Zakres badań Apiwarolu AS w latach 1981-2009

W pracy analizowano dane z piśmiennictwa dotyczące skuteczności Apiwarolu AS. Zebrane dane podzielono na cztery okresy: dla lat 1981-1985, 1986-1989, 1990-2000 i 2001-2009 i przedstawiono w tabelach 1, 2, 3 i 4. Szczególnie po 1985 roku lek doczekał się publikacji wyników badań z wielu ośrodków naukowo-badawczych. Autorzy prowadzili badania właściwości Apiwarolu w różnych układach doświadczalnych, wnosząc szereg interesujących obserwacji z zakresu farmakodynamiki i farmakokinetyki leku.

Badano wpływ Apiwarolu AS (amitrazu) na rozwój matek pszczelich i nie stwierdzono wyraźnie negatywnego wpływu leku, chociaż odymianie zmniejszało liczbę unasienianych matek. Nie stwierdzono, aby odymianie wielokrotnymi dawkami niekorzystnie wpływało na rozwój czerwiu. Nie obserwowano zamierania czerwiu, jego niedorozwoju lub upośledzenia wygryzających się pszczół. Bah notował ujemny wpływ preparatów warrozowych na rozwój czerwiu, zauważając najmniejszą toksyczność Apiwarolu AS. Badania różnych leków warrozowych na przeżywalność pszczół prowadzone przez Gromiszów wykazały, że zabiegi z dawkami większymi od leczniczych zmniejszały przeżywalność pszczół, a efekt leczniczy najszybciej pojawiał się po Apiwarolu AS. Jak podają Hurny, Moskal i Londzin, badane preparaty w zalecanych dawkach nie wpływają ujemnie na larwy pszczele. Jego wpływ na masę ciała pszczół przy porównaniu różnicy pomiędzy grupą kontrolną a grupami doświadczalnymi nie zaznaczał się istotnie. Badano wybrane elementy odporności u pszczół oraz właściwości immunomodulacyjne Apiwarolu AS oraz wpływ środków warrozobójczych na temperaturę gniazda, a także bakterie jelita środkowego, stwierdzając niewielkie, przejściowe odchylenia badanych parametrów od normy. Amitraz rzadko wykrywano w miodzie, a stwierdzone pozostałości były niższe od wyznaczonego poziomu MRL. Stwierdzono, że substancja szybko ulegała rozkładowi tak w miodzie, jak i w wosku. Przytoczone wyniki badań wskazują jednoznacznie, że Apiwarol AS nie wpływał ujemnie na rozwój czerwiu, larw, nie prowadził do dysfunkcji rodziny pszczelej i pojedynczych osobników, a stosowany w zalecanych dawkach nie pozostawał w ilościach szkodliwych dla konsumenta. Na podstawie przytoczonych badań można przyjąć, że Apiwarol AS jest lekiem nieszkodliwym i bezpiecznym.

Ocena skuteczności preparatu

Najbardziej interesującą i najczęściej badaną właściwością Apiwarolu AS była efektywność jego działania na Varroa destructor. Badania prowadzono w laboratoriach i w pasiekach bezpośrednio z lekiem lub w porównaniu z innymi lekami przeciwwarrozowymi. Zainteresowanie tym zagadnieniem jest zrozumiałe i ma nie tylko poznawcze, ale również duże znaczenie praktyczne. Długi okres stosowania Apiwarolu AS w praktyce zwalczania warrozy oraz bogata literatura pozwala na rzetelną ocenę.

Według badań ankietowych stosowanie Apiwarolu AS kształtowało się na poziomie 5,0% do 35,1% i w niektórych latach było największe wśród leków zarejestrowanych w Polsce. W pierwszych latach stosowania amitrazu jako substancji czynnej Apiwarolu AS, skuteczność zabiegów wynosiła od 84,2% do 100% (tab. 1, poz. 6). Wysokie wyniki skuteczności otrzymali Kostecki i Romaniuk w latach 1981-1985. Podobną skuteczność zabiegów we Włoszech wykazał Marchetti. Konopacka w 1986 roku zwróciła uwagę na odmienności w dynamice Apiwarolu AS, potwierdzając jego wysoką skuteczność (98,0%) oraz podała czynniki, mające istotny wpływ na skuteczność zabiegów. Badania prowadzone 10 lat później wykazały podobną, wysoką skuteczność warrozobójczą leku. Analiza 750 prób pszczół i około 200 osypów zebranych w czasie wieloletnich badań prowadzonych od roku 1986 do 2000 roku w pasiekach, w których zwalczano warrozę, stosując tylko Apiwarol AS, wskazuje, że lek ten cechuje stabilna i wysoka skuteczność. Ocena skuteczności Apiwarolu AS, jaką przeprowadziła Konopacka w 2001 roku, wskazuje, że po trzech odymieniach ginie 88,69-100% pasożytów. Podobne wyniki w zwalczaniu warrozy odnotowano we Francji, Włoszech, Nowej Zelandii, Słowacji i w Czechach, gdzie amitraz o działaniu kontaktowym stosowany jest od ponad 20 lat.

Liczni autorzy stwierdzają, że skuteczność zabiegów zależy od wielu czynników, ale decydująca jest ilość czerwiu w rodzinie pszczelej w okresie wykonywania zabiegów. Apiwarol AS działa tylko na pasożyty znajdujące się na pszczołach, nie działa na pasożyty pod zasklepem. Z ogólnej liczby pasożytów w rodzinie około 20% bytuje na pszczołach i aż 80 % znajduje się na czerwiu. W rodzinach, w których czerw zajmował 10,3-12,9 dm2, skuteczność wynosiła 37,19%, przy mniejszej powierzchni - od 8,4 do 9,7 dm2 - skuteczność wzrastała do 64,62 %, natomiast przy czerwiu zajmującym mniej niż 6 dm2 skuteczność wynosiła 98,06%. Dlatego ulotki producenta zalecają kilkakrotne stosowanie leku. Właściwe wykonanie zabiegu, okres rozpoczęcia leczenia, pora dnia i liczba odymień wpływają na efektywność leczenia pszczół.

Istotne wydają się wyniki uzyskane przez Sokoła i Michalczyka w 2009 roku, które mówią, że po 8-tygodniowym pozostawieniu w 10 rodzinach pasków Biowaru, tylko w 4 wykazano warrozę, a w pozostałych 6 nie stwierdzono roztoczy. Dodatkowe odymianie pszczół Apiwarolem wykazało, że w 6 rodzinach, gdzie w ostatnim badaniu nie wykryto pasożytów, na dennicę opadło 2-56, a w pozostałych dwóch odpowiednio 220-300 samic Varroa destructor. Natomiast w 4 rodzinach z warrozą na wkładkę dennicową opadło od 19 do 400 roztoczy. Te najnowsze wyniki badań jednoznacznie (chociaż nie było to zamierzone) potwierdziły wysoką skuteczność odymiania Apiwarolem AS. Wymienione obserwacje uzasadniają podjęcie dalszych porównawczych badań skuteczności oraz kształtowania się oporności Varroa destructor na amitrazę, substancję czynną Apiwarolu i Biowaru. Wyniki oparte na reprezentatywnym materiale mogą przynieść jednoznaczną odpowiedź odnośnie ich biorównoważności i dalszego stosowania w praktyce.

Analizę wyników badania skuteczności Apiwarolu AS od 1981 do 2009 roku umożliwiło pogrupowanie danych dla czterech okresów jego stosowania (tab.). W ocenie średnich i odchyleń standardowych oraz przy porównywaniu testem t-Studenta trzech analizowanych grup wyników nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych pomiędzy okresami 1981-1985; 1986-1989; 1990-2000 i 2001-2009. Średnie w wymienionych przedziałach wynosiły odpowiednio 93,89±4,73%, 95,70±3,46, 94,27±4,07 i 93,72±7,01% skuteczności leku.

Jak uwidoczniono w tabeli 1, osiągano także sporadycznie niższe wyniki skuteczności leczenia. Romaniuk uzyskał skuteczność na poziomie 51,8% (tab. 1, poz. 6), stosując preparat o zawartości 6,25 mg amitrazy w tabletce. Podobne wyniki otrzymała Bieńkowska (tab.1, poz. 13), stosując lek przy dużej obecności czerwiu w czasie zabiegów. Wymienione wyniki świadczące o niskiej skuteczności Apiwarolu AS wynikały z zastosowania zmniejszonej dawki. Zatem niewłączenie tych wyników jako skrajnych do obliczeń średnich dla grup, umożliwiło reprezentatywne wnioskowanie o jednakowej skuteczności leczenia w poszczególnych okresach stosowania leku z uwagi na brak różnic statystycznie istotnych przy PŁ0,05. W rezultacie analizy statystycznej zebranych wyników przedstawionych w tabeli można przyjąć, że Apiwarol AS zawierający amitrazę jako substancję czynną w formie odymiania wykazuje skuteczność w granicach 94,4%. Należy zaznaczyć, że analiza wyników skuteczności nie była łatwa do interpretacji. Autorzy publikacji prowadzili badania w różnym czasie, w odmiennych warunkach klimatycznych, w różnych porach sezonu pasiecznego i nie zawsze przy podobnym stanie rozwoju rodziny pszczelej oraz w podobnych, ale nie takich samych układach doświadczalnych z odmienną niekiedy metodą szacowania wyników. Wobec powyższego w tym opracowaniu ocenę skuteczności sprowadzono do danych w wymiarze ilościowym, uwzględniając nieliczne estymacje danymi liczbowymi, które podano w legendzie tabeli 1.

Wnioski

Podsumowując wyniki wieloletnich badań Apiwarolu AS, należy podkreślić, że umożliwiają one rzetelną ocenę leku przedstawioną w opracowaniu odnośnie jego istotnych właściwości farmakodynamicznych. Wyniki badań pokazują, że Apiwarol AS jest lekiem skutecznym, który nie uległ istotnej zmianie jakościowej w okresie stosowania w zwalczaniu warrozy od 1981 roku. Ponadto wszechstronnie przeprowadzone badania wskazują, że Apiwarol AS jest lekiem bezpiecznym i nieszkodliwym, niezakłócającym procesu rozwoju larwalnego i niewpływającym ujemnie na funkcjonowanie rodziny pszczelej. Praktycznie amitraza nie pozostaje w produktach pszczelich w ilościach stanowiących zagrożenie toksykologiczno-higieniczne. Stwierdzane zawartości nie przekraczają wartości MRL, do czego przyczynia się stosunkowo szybki rozkład tej substancji. Pojawiające się wątpliwości o skuteczności nie znajdują uzasadnienia w świetle przedstawionych danych, a zdarzające się przypadki niższej skuteczności są najczęściej wynikiem niestosowania się do zaleceń właściwej terapii i nie wpływają na ogólną ocenę leku. Nieliczne i nie w pełni reprezentatywne badania Biowaru, w porównaniu do liczby i zakresu badań Apiwarolu, nie pozwalają na rzetelną ocenę działania na pszczoły i pasożyta w zakresie ich biorównoważności i powstawania oporności.

Przedstawione wyniki badań statystycznych są dowodem, że po stosowaniu Apiwarolu AS nie wykształca się oporność u Varroa destructor, a jeżeli takie zjawisko ma miejsce, to ma nieznaczący wpływ na skuteczność. Mając na uwadze duże różnice pomiędzy Apiwarolem AS a Biowarem dotyczące czasu ekspozycji i ilości substancji czynnej w ulu, można przypuszczać, że po stosowaniu Biowaru oporność na amitrazę u Varroa destructor może pojawić się dużo szybciej i w znacznie większym stopniu, niż po stosowaniu Apiwarolu AS.

Znamy dokładnie mechanizm powstawania oporności oraz budowę chemiczną i sposób farmakologicznego działania amitrazy w organizmie pasożyta. Nauka polska ma do dyspozycji nowoczesne metody badawcze pozwalające określić modele farmakodynamiczne i farmakokinetyczne substancji, a badaniem in vitro czy in silico można wykonać symulację działania substancji w żywym organizmie zanim rozpocznie się żmudne i kosztowne badania terenowe. Analiza QSAR (quantitative structure activity relationship) może dać odpowiedź, czy oddziaływanie amitrazu - pasożyt spełnia warunki umożliwiające powstanie oporności. Należy sądzić, że to stosunkowo nowe i ciekawe zagadnienie będzie przedmiotem badań, które przyniosą nowe dane pozwalające na jego dokładniejsze poznanie i określenie skutków stosowania w praktyce.